人視網膜色素上皮細胞的培養(yǎng)和鑒定
上皮細胞覆蓋于身體表面并襯貼于體內空腔器官腔面的細胞。其排列有明顯極性，一面朝向身體表面或腔面，稱游離面；一面向著深部的結締組織，稱基底面。上皮細胞具有強大的角生和更新能力。上皮組織具有保護、吸收、分泌和排泄等作用。當上皮細胞受損時，則影響機體的防御功能。
人視網膜色素上皮細胞分離自視網膜組織；視網膜色素上皮（RPE）位于脈絡膜和光感受器細胞外節(jié)之間，是視網膜下腔和脈絡膜血管之間的離子、水、營養(yǎng)物質和代謝終產物轉運通道；主要是由單層色素上皮細胞所構成，排列十分規(guī)則。人視網膜色素上皮參與視黃醇循環(huán)，吞噬脫落的光感受器細胞外節(jié)以維持光感受器細胞興奮性，并分泌多種生長因子，幫助維持脈絡膜血管內皮細胞和光感受器細胞的結構完整性。細胞呈多角形，細胞分為三部分，即頂部、體部和基底部。
人視網膜色素上皮細胞無再生能力，細胞死亡后不被替換，而是鄰近的細胞向側面滑動，以填補死亡細胞遺留下來的空間。人視網膜色素上皮位于脈絡膜和光感受器細胞外節(jié)之間，是視網膜下腔和脈絡膜血管之間的離子、水、營養(yǎng)物質和代謝終產物轉運通道。人視網膜色素上皮參與視黃醇循環(huán)，吞噬脫落的光感受器細胞外節(jié)以維持光感受器細胞興奮性，并分泌多種生長因子，幫助維持脈絡膜血管內皮細胞和光感受器細胞的結構完整性。
凍存和復蘇
根據慢凍速融的細胞凍存原則，將原代或傳代1-2次培養(yǎng)的人視網膜色素上皮細胞，加入10％二甲基亞砜作為保護劑，液氮中凍存。復蘇時將凍存細胞在60℃、2分鐘內融化，用臺盼藍染色測定細胞存活率，用抗人角蛋白抗體免疫細胞化學染色作細胞鑒定，每日計算細胞數以確定細胞生長曲線。結果顯示經凍存復蘇后的人視網膜色素上皮細胞的存活率達90％，生長狀態(tài)與對照組無差異，抗人角蛋白染色陽性，細胞對數生長期在1-4天，群體細胞倍增期約為1.55天。因此人視網膜色素上皮細胞液氮凍存可保持生物活性，復蘇后生長良好，保持了細胞特征。這可提供細胞系，方便了體外實驗，并可能作為人視網膜色素上皮細胞移植治療一些眼底病的細胞庫。
培養(yǎng)和鑒定
有研究進行人視網膜色素上皮細胞的體外培養(yǎng)，為研究其生理功能、生化特征和病理過程提供細胞模型。
方法：用改良的眼杯縫線固定法，將其固定在眼球托上，通過消化獲取人人視網膜色素上皮細胞，作細胞形態(tài)學、組織化學和電鏡鑒定。
人視網膜色素上皮細胞培養(yǎng)早期生長活躍、胞核透明、胞漿含豐富黑色素顆粒，Ｇｉｅｍｓａ染色見染色體，ＤＯＰＡ氧化酶呈陽性反應，透射電鏡見細胞微絨毛及緊密連接。、人視網膜色素上皮細胞經體外培養(yǎng)及短期傳代后，仍具有與體內細胞相似形態(tài)特征?？蔀槿艘暰W膜色素上皮細胞的深入研究提供豐富的實驗研究材料。
相關研究
有實驗研究可見光照對培養(yǎng)的人視網膜色素上皮(retinalpigmentepithelium，RPE)細胞凋亡的影響。以白色熒光燈為光源，用500lx、(2000±500)lx及(3400±200)lx不同光照強度，按不同的光照時間(無光照、6、12、24h)照射培養(yǎng)的人RPE細胞。利用終末脫氧核糖核苷酸轉移酶介導的原位缺口末端標記(TUNEL)、熒光素標記的連接素V/碘化丙錠(AnnexinV-FITC/PI)雙染色流式細胞測定、相差倒置顯微鏡等手段觀察RPE細胞凋亡(分為光照后6、12、24、36h組)。結果可觀察到RPE細胞出現兩種死亡形式，凋亡與壞死。
低于一定閾值(500lx)的光照對細胞損傷較輕，細胞凋亡及壞死隨光照強度的增加而增加。
在較短的光照時間(6h和12h)內，細胞死亡的增加以凋亡為主；隨著光照時間的延長，細胞壞死逐漸明顯。
隨著光照后培養(yǎng)時間的延長，細胞凋亡明顯增加(P0.05)。光照后6、12、24h的損傷改變以凋亡為主，但隨時間的延長，凋亡繼發(fā)性壞死的增加顯著。光照后36h，細胞的壞死數顯著增高。
此外，有研究探討天冬酰胺特異酶切的半胱氨酸蛋白酶(caspase)成員caspase-3在柔紅霉素誘導的人視網膜色素上皮(RPE)細胞凋亡中的變化。方法：原代培養(yǎng)的人RPE細胞經200μg·L-1柔紅霉素誘導8，24和36h后，按照caspase-3熒光檢測試劑盒說明處理細胞，再通過熒光比色法間接檢測細胞碎片中caspase-3的活性。結果正常caspase-3的活性為(0.094±0.005)nmolAFC，8h后增加為(0.446±0.029)nmolAFC，24h后為(0.754±0.056)nmolAFC，36h又下降到(0.486±0.033)nmolAFC，但都高于正常水平。加入特異性四肽抑制物DEVD-CHO1μL后活性為(0.040±0.003)nmolAFC，顯著低于正常。因此Caspase-3參與了柔紅霉素誘導的人視網膜色素上皮細胞的凋亡，柔紅霉素可使其活性增加。
另外，有研究探討藍光光照對體外培養(yǎng)的人視網膜色素上皮(RPE)細胞凋亡及對線粒體膜通透性轉運功能的影響。方法用藍光光照體外培養(yǎng)的人RPE細胞。實驗分為三部分。第一部分：不同光照度，分為3組，第1組光照度(500±100)lx，第2組光照度(2000±500)lx，第3組光照度(3000±500)lx；光照RPE細胞時間6h，光照結束后24h終止培養(yǎng)。第二部分：同一光照度、不同光照時間，檢測RPE細胞亞型時分為3組，第1組光照時間6h，第2組光照時間12h，第3組光照時間24h，光照度均為(2000±500)lx；檢測線粒體膜電位時也分為3組，第1組光照時間3h，第2組光照時間6h，第3組光照時間12h。
